Все госты и снипы онлайн

Более 10000 документов в открытом доступе, абсолютно бесплатно

ГОСТ 26075-84 - Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики бешенства

Этот документ был распознан автоматически. В блоке справа Вы можете найти скан-копию. Мы работаем над ручным распознаванием документов, однако это титанический труд и на него уходит очень много времени. Если Вы хотите помочь нам и ускорить обработку документов, Вы всегда можете сделать это, пожертвовав нам небольшую сумму денег.

Файлы для печати:

46675-27

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ

МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА

ГОСТ 26075—84 (CT C3B 3452-81)

Издание офицмальное

Цена 3 ком,


РАЗРАБОТАН Ммынистерством сельского хозяйства СССР ИСПОЛНИТЕЛИ

5. И. Антомоа, Л. П. Кэменева ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР

Зам. начальмика Глазного управления ветеринарми П. П. Размамми

УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановленмем Государст- венного комитета СССР по стандартам от 9 января 1984 г. № 48


УДК 636: $76.5.07:006.354 Группа С79

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР a

ЖИВОТНЫЕ ГОСТ

ФАетоды лабораторной бешенства 26075—84

Agneultural animals

Methods cf laboratary diagnostics of radies [ст 3452—81}

ОКСТУ 9809

Постановлеммем Государственного комитета СССР по стоидартам от ® января 1984 г. № 48 срок действия установлен < 01.07.84

Ao 61.07.89

\Несобяюдение стандарте преследуется по замону

Настоящий стандарт распространяется на все виды животных и устанавливает методы лабораторной диагностики заболевания бешенством, нызываемого рабдовирусом.

Стандарт применяюг ирн диагностнке заболевания животных н лабораториях ветерннарных научно-исследовательских учреждений. республиканских и областных — лабораторнях

Славдарт полностью соответствует СТ СЭВ 3452--81.

4. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

1.1. Для проведення исследований на бешенство в лабораторию направляют свежне трупы мелких животных целиком, от крупных Животных - - ГОЛОВНОЙ МОЗГ.

Для постановки бнопробы допускается непользовать пробы мозга. консервированные в 30 --50% -ном растворе глицерина,

: 0. Отобранный для исследования патологический — материал унзковывают во влагонепроницаемую тару н в металлических контейнерах достанляют в лабораторию.

1.3. Патологический материал сопровождают докуменгом, содержащим следукицие данные:

наименование и адрес отправителя.

ВИД животного;

анамнестические и клиннко-эпизоотологические данные.

Издание офицмельное Перепечатка воспрещема © Издательство стандартов, 1984

2 > 9


Crp. 2 ГОСТ 26075—934

2. МЕТОД ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Сущность метода заключается в соединении меченых антител со специфическим антигеном и наблюдении светящихся комплексов «антитело-антиген» в полях зрения люмннесцентиого мнкрос- копа.

2.1. Аппаратура, материалы, реактивы и растворы

Микроскоп люминесцентный.

Термостат с температурой нагрева 37°С.

Холодильник.

Стекла предметные по ГОСТ 9284—75.

Пробиркн бактериологические по ГОСТ 25336-82.

Чашки Петри no TOCT 25336—82.

no FOCT 26292—74,

Набор инструментов для вскрытия черепной полости и извлечения головного мозга животных.

Пинцеты по ГОСТ 21241. -77.

Горе..ка газовая или съиртовая.

Ацетон по ГОСТ 2603—79.

Диагностический иммупотлобулин флуоресцирующий знтнра бнческий (ДАФИ).

Масло нефлуоресцирующее иммерсионное по ГОСТ 13739-78.

Вода по ГОСТ 6709—72.

Раствор фосфатный буферный, рН 74.

2.2. Подготовка к исследованию

2.2.1. Из каждого отдела головного мозга (амыонова рога, моз. жечка. коры больших полушарий и продолговатого мозга) готовят по два препарата — мазка-отпечатка.

Не допускаются для исследования пробы, консервировазные глицерином, фиксированные этиловым спиртом, формалином и лр\ - гими средствами, вызывающими денатурацию н разрушение анлитенов или создающимн дополнительный (<свой») фон свечегая.



2.2.2. Препараты высушнвают нз воздухе и фиксируют в ох- лажденном ацетоне при плюс 4 или минус 12°С в течение 4—1 ч. Затем препараты извлекают из ацетона, высушивают на воздухе 10 15 мин н помещают нх во влажную камеру (чашки Петри с увляжненным дном).

2.2.3. Диагностический антирабический флуоресцирующий нммуно: лобулин (ДАФИ) в рабочем разведении наносят равномерно из всю поверхность препарата при помощи пнпетки (примерно 0,1 см? на один препарат), закрывают камеру с препаратами, помешают в термостат н выдерживают 30 мин при 37С. Затем предметные стекла с препаратом троекратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин 8 сасуд, наполненный фосфатным


ГОСТ 26075—84 Crp. 3

буфером pH 7,4, промывают дистнллированной водой и высу- шивают на воздухе.

На окрашенные препараты наносят вммерсионное нефлуоресцирующее масло.

2.3. Проведение нсследования

23.1. Подготовленные препараты просматривают под люминес- пентным микроскопом с нымерсионной системой.

2.4. Обработка результатов

2.4.1. При положительных результатах исследования в препаратах, содержащих антитен вируса бешенства, обнаруживают рззной величины и формы ярко светящиеся желто-зеленым цветом гранулы в нейронах и вне клеток. Размер их колеблется от елва заметных в внде песчинок образований до 15—20 мм:

Не пораженная вирусом бешенства мозговая нервная ткань светится тусклым серовато-желтым илн зеленоватым цветом.

3. МЕТОД ПОДАВЛЕНИЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

Сущность метода заключается в способности рабического антнгена, связанного с нефлуоресцирующими антнтеламн, зторично не входнть в ‹оедннение с флуоресцирующим специфическим коньюгатом. Это свойство используется для доказательства спецнфичностн свечения комплекса «антиген-антитело» при исследовании препаратов, предварительно не обрабатываемых нефлуорес- цирующими антителами.

3.1. Аппаратура, матерналы, реактивы н растворы

341.1. Аппаратура, материалы, реактивы и растворы, указанные вл. 2.1, и дополнительно:

нммуноглобулин 5%-ный антнрабническийя нефлуоресциирующий моноспенифический;

раствор физиологический нейтральный.

3.2. Подготовка к исследованию

3.2.1. На фиксированные препараты, приготовленные нз исследуемых унастков головного мозга, наносят пипеткой 5%-пый антнрабический монослецифический иммуноглобулин, выдерживают нх в течение 30 мнн во влажной камере в тер- мостате гри 37°С. Затем препараты промывают двукратно нейт- ральным физиологическим раствором н окрашнвают — антирабнческим флуоресцирующим иммуноглобулином (ДАФИ) по п. 2.2.3.

3.3, Провеление исследования

3.3.1. Препараты просматривают под люминесцентным микрос- копом с иммерснонной системой.

3.4. Обработка результатов

3.4.1. В препаратах, содержащих антнген вируса бешенства, лрелварительно обработанных нефлуоресцирующим ин затем флуо-


Crp. 4 ГОСТ

ресцирующим иммуноглобулином, свечения не должно быть ав препаратах, ранее обработанных только флуоресцирующим пммуноглобулином наблюдают спеинфическое свечение,

4. МЕТОД РЕАКЦИН ПРЕЦИПИТАЦИИ

Сушность метода заключается в свойстве антител-прецини!и нов и гомологичных им антигенов диффундиравать в згарояом гс- ле и при соедннении образовывать видимые визуально линии преципитатов-комплексов «актитело-антиген».

Этим методом допускается исследовать несвежий патологичес- кий материал. контаминированный бактернальный мнкрофлорой

4.1. Аппаратура, матермалы н реактивы

Гермостат.

Баня водяная.

Осветнтель для бактернологических работ.

Пипеткн мерные и ластеровскяе по ГОСТ 20292.74.

Чашки Петри по ГОСТ 25336 82.

Трубка металлическая тонкостенная днаметром 4 5 мм.

Перо пнсчее

Натрий хлористый по ГОСТ 4233. -77.

Метиловый оранжевый, 1\%-ный раствоор в 50%-ном этилоном спирте по ГОСТ 5962—67.

Мертнолят.

Днагностический нм муноглобулин антирабический

Антиген отрицательный контрольный.

Антиген положительный контрольный.

Вода листиллированная по ГОСТ 6709—72.

Гель агаровый биофабричного изготанления или присотовлен- HW Ne

агар-агар «Дифко» или аналогичный 15 т.

натрий хлористый - - 8.5 г,

| \%-ный раствор метилового оранжевого

в 5 этиловом спирте —19 см, мертнолят -— г, вода днстиллированная -- 1000 смз.

Агаровый гель с рН 7,2-7,4 разливают в стернльную посуду, автоклавируют при 0,5 атм в тсчение 30 мин, хранят в холодиль- нике при 4С.

42. Проведение исследования

42.1. Реакцию преципитации {РП) ставят на обезжиренных предметных стеклах, на которые предварительно наносят каплю расплавленного агара. пипеткой равномерно распределия се по стеклу, и делают тонкий мазок. На застывший слой агара наливают снерху 2,5 см3 агарового геля толщиной приблизительно 2 мм.




ГОСТ 26075—94 Стр. $

После застывания агара делают в нем лункн металлической тонкостенной трубочкой диаметром 4—5,6 мм согласно трафарегх. Агаровые столбики осторожно извлекают ученическим пером, ие допуская отслаивания от стекла тонкого слоя агарового геля.

ВРИ! исследуют от крупных животных (лошадей, крупного рогатого скота, собак, лисиц и др.) следующие частн головного мазга—кору полушарий левой и правой сторон, аммоновы рога левый н правый, мозжечок н продолговатый мозг. У мелких живот- ных РИ ставят с какнми-лноо тремя отделами мозга. От мышей нс- следуют несь головной мозг. который растирают в ступке нлн в сямой черенной коробке в массу пастообразной консистенции.

„1 ав оду Шви Положительная РП со ьсемн Pe weds WAY Ua fie - . а вам рые (левый До зичоном разве деннями глобулниа рог (правый). Е—мезжич: ЖЫ— Черт 2 предолгоматый чот. 23+. лунка < разнецелием т406\ чина соответственно 1.4. ГВ, bb

Черт. 7

Подготовленные предметные стёкла помещают во влажную камеру (чашкн Петри с увлажненным дном) и при постановке резкции лункн заполняют патологическим матерналом н диагностическим антирабическим иммуноглобулином (черт. 1--1).

В центральные лунки, обозначенные на трафарете А.В,С.Д.Е,Ж, вносят исследуемый патолоснческий материал, в периферические лунки 1,2,3.4, (см, черт. 1) — диагностический антнирабический иммуноглобулин {1- 2 капли) в разведениях 1:2. 1:4, 1:8, 1:16 {от нехолного разведення) на физиологическом растворе.

Одновременно ставят контрольные опыты с положительными н отрицательным антигенами, по каждый на отдельном стекле, ис- пользуя те же разведення нммуноглобулина.

После заполнения лунок соответствующими компонентами чаш- ки Петри (влажные камеры) помещают в термостат прин 37°С на в ч. Затем нылерживают чашки при комнатной температуре еще 42 ч.


Стр. 6 ГОСТ 26075—8:

© оо ФО О, ©) хо

Положительная РЛ с развелеПоложительная РП с паляеле нинми глобулина 1:4, 1:8, 1:16 ннем гхобулина 116, отсутегЧерт. 3 вуст РП с разнелениямя |2. 1:4, 1:8 Черт. 4 Реакиню преципитации учитывают через 6, 24. 48 ч после ее пос- тановки. Предметные стекла просматривают визуально в затемненной комнате, просвечивая нх осветителем снизу вверх под углом 45°. 4.3. Обработка результатов 4.3.1. Реакцию считают положительной прн появлении одной или двух трех линий приципитации любой интенсивности между лунками, содержащими антиген и нммуноглобулин

5. МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ ТЕЛЕЦ БАБЕША-НЕГРИ

Сущность метода заключается в выявлении в клетках нервеой ткани специфических цитоплазматических включений — телец BaGbema-Hei pi.

Метод выявления телец Бабеша-Негри является ным н имеег диагностическое значение только при обнаружении типичных, слепифическнх включений.

5.1. Аппаратура, матерналы и реактивы

Микроскоп бнологический по ГОСТ 8284 —78.

Стекла предметные по ГОСТ 9284 —75.

Пиистки мерные по ГОСТ 20292—74.

Красктель Селлерса.

Буфер фосфатный рН 70—75.

2.2. Подготовка к исследованию

5.2.1. Готовят мазки-отиечатки из аммонового рога, коры боль- ших полушарий, мозжечка, продолговатоо мозга и окрашивьют по методу Селлерса.

На свежие не высохшие препараты наносят на 10—30 с краситель Селлерса (одну часть 1%-ного раствора основного фуксина смешивают с двумя частями 1%-ного раствора метиленового сичего.} После окраски препараты промывают фосфатным буферным


ГОСТ 26075—84 Crp. 7

раствором и высушивают в вертикальном положении при комнат- ной температуре.

5.3 Проведение иследования

53.1. Препараты просматривают под биологическим микроскопом с иммерснонной снстемой.

5.4. Обработка результатов

5.4.1. Положительным результатом неследования считают наличие специфических телец Бабеша-Негри, которые представляют собой четко очерченные овальные яли продо.моватые гранулированные образования диаметром 2—10 мм, розово-краского цвета, расположенные в нейтронах, а также вне их.

От типичных гранулированных включений. обнаруживаемых прн бешенстве, следует отличать включения негранулированные, обнаруживаемые при некоторых других инфекииях, поражающих центральную нервную систему.

6. МЕТОД БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ

Сущность метода заключастся в выделенни вируса от сольных убитых WAH павших жнвотных путем ниокулнрования патологичес- кого матернала белым мышам и последующен его идентификации.

Биопробу проводят, если выявление рабического антигена методом иммунофлуоресценции (нлн РП н определение телец Бзбеша-Негрн) в первичном материале окажется отрицательным.

6.1. Аппаратура, матерналы м растворы

Центрифуга с частотой вращения 2000 об/мин

Пробнркн центрифужные.

Стуики.

Ширицы с нгламн.

Посуда для содержания мышей,

Антибнотики (сгрептомицин, |

Раствор нейтральный фнзиологическяй.

6.2. Подготовка к исследованию

62.1. Материал для сражения мышей готовяг нз равных час- тей нервной ткани аммонова рога, мозжечка. коры полушарий, продолговатого мозга.



Ткань измельчают ножницами и растирают в ступке (нли гомогенизаторе), постеленно прибавляя нейтральный физнологический раствор до получения 10%-ной суспензии.

6.2.2. Суспензию центрифугируют с частотой нрашения 2000 об:мнн в течение 5-—10 мин. Надосадочную жидкость переио. сят в стерильную пробирку и хранят в холодильнике при темиературе 0--4°С до ее использовзния. При подозрении на бактериальную нестерильность в сусиензию добавляют 500 МЕ пенинилли.


С:р 8 ГОСТ 16075-34

на и 200 МЕ стрептомицина на 1 см? суспензии и затем выдержнвают ее при комнатной температуре 30 мин.

6.3. Проведение исследования

5.3.1. Для биопробы берут белых лабораторных мышей мас- сой 16-20 т или сосунков в возрасте 20—25 сут массой 6-8 г.

Мыщей заражают подготовленной суспензией ннтрацеребра ль- но в дозе 0,015—0,03 см? в зависнмости от массы мышей или полкожно в верхнюю губу в дозе 0,1-.0,2 смз.

Яа одну бнопробу заражают 6-10 мышей.

Зараженных ‘мышей помещают в клетки илн банки, на которые наклеивают этикетку с указанием даты заражения, количества мышей, способа заражения н номера экспертизы. Горловину банки накрывают сеткой, препитствующей проникяовению насекомых.

Зараженных мышей осматривают ежедневно в течение 30 сут. Количество здороных, больных и погибших мышей регистрируют в журнале.

8.4. Обработка результатов

6.4.1. При оценке результатов учитывают проявление канянческих признаков у зараженных мышей:

шерсти;

тремор;

нарушение координации движения;

параличи;

прострация;

Гибель зараженных мышей в срок до 48 ч не учитываюг в оценке результатоя. Or павших после указанного срока, толовной молг нсследуют, как указано в разд. 2-5.

6.4.2. Биологическую пробу на бешенство считают положительной, если в препаратах из мозга зараженных мышей ›бнар’,- живают тельца Бабеша-Негрн илн выявляют антиген методами иммунофлуоресценции или в реакции преципитации

6.4.3. днагноз wa бешенство может быть дан только по истеченни 30-суточной постановки биопробы при отсут. ствин специфической гибели мышей.

7. МЕТОД СПЕЦИФИЧЕСКОЙ БУОЛОГИЧЕСКОЯ ПРОБЫ

Сущность метода заключается в том, что мыши, зараженные мозговой тканью больных бешенством животных, заболевают бешенством, а зараженные тканью, предварительно обработанной антнрабической сывороткой (иммуноглобулином), не заболевают.

7.1. Аппаратура, матерналы, реактнвы н растворы

7.1.1. Аппаратура. материалы ин реактивы, указанные и п. 6.1, н дополнительно:


ГОСТ 126975—84 Стр. 9

баня водяная;

сыворотка гипериммунная антирабическая (или иммуноглобу- лин);

сыворотка нормальная или физиологический раствор, РН 7.2—7.4.

7.2. Подготовка к нсследованию

7.2.1. Для проведения специфической бнопробы отбирают 12 белых мышей (п. 6.3.1). Материал для заражения мышей готовят по п. 6.2.

7.2.2. Подготовленную для зараження суспензию разливают в две пробирки по 3 смз. Затем в одну из них вносят 3 см? антирабической гипернымунной сыворотки или иммуноглобулин, в другую — 3 см* нормальной сывороткн или физнологический раствор РН 7.2--7,4. Обе пробирки выдерживают в водяной бане в течение 10 мин при З7С.

73. Проведение нсследования

Каждой смесью заражают по шесть белых мышей интрацеребрально и дозе 0,015—0.03 см? или в губу в дозе 0,1--0,2

7.4. Обработка результатов

7.4.1. Положительным на бешенство результатом специфичес- кой биопробы считают гибель мышей, зараженных матерналом, обработанным нормальной сывороткой нли физнологическим раст- вором в течение 30 сут. При этом мыши, инфицированные MaTe- рналом после обработки антирабической нмымунной сывороткой HOH иммуноглобулином. должны остаться живыми.

7.4.2. Отрицательный днатноз на бешенство может быть дан только по истечении 30 сут постановки биопробы, если нег спецнфической гибели мышей.


Реджжтор Р. С. Федорова Технический редактор В. Н. Малькова Корректор Н. Б. Жуховцени

Сдано ъ наб. 17.0:.84 Подл. ‹ сеч. 18.08.84 0.75 хсл. я. л 0.75 усл. кр.-отт. M62 yews. a. Tapax 16000 Цена 3 коп.

Обфдема «Зах Почета» Нодательство cramgapros, 1273557. Москва, Новопресменский пер, 3. Калужекач типография станхьртой, ve Мосховская. 250. Зак С


Похожие документы