Все госты и снипы онлайн

Более 10000 документов в открытом доступе, абсолютно бесплатно

ГОСТ 26075-84 - Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики бешенства

Этот документ был распознан автоматически. В блоке справа Вы можете найти скан-копию. Мы работаем над ручным распознаванием документов, однако это титанический труд и на него уходит очень много времени. Если Вы хотите помочь нам и ускорить обработку документов, Вы всегда можете сделать это, пожертвовав нам небольшую сумму денег.

Файлы для печати:

ШУ S ' - Л У Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й С Т А Н Д А Р Т С О Ю З А С С Р ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА ГОСТ 26075-84 (СТ СЭВ 3452-81) Издание официальное коп. 3 а н е Ц ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ст_ ........ М осквапромышленная безопасность опасных производственных объектов
РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР ИСПОЛНИТЕЛИ Б. И. А нтоне», л. П. К а м е н е м ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР З ам. начальника Главного управления в етеринарии П. П . Ражманми УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государст- венного комитета СССР по стандартам от 9 января 1984 г. № 48
УДК 636:174.8.07:006.354 Групп* С79 Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й С Т А Н Д А Р Т С О Ю З А С С Р ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ ГОСТ Методы лабораторией диагностики бешенства 2 6 0 7 5 -8 4 Agricultural animals. Methods of labor#ton- diagnostics of rabies (CT СЭВ 3452— 81) О К С Г У 9809 Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 9 января 1984 г. М® 48 срок действия установлен С 01.07.84 д о 01.07.89 ^Несоблюдение стандарта преследуется по закону Настоящий стандарт распространяется на все виды животных и устанавливает методы лабораторной диагностики заболевания бешенством, вызываемого рабдовирусом. Стандарт применяют при диагностике заболевания животных в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учрежде­ ний. республиканских и областных ветеринарных лабораториях Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 3452—81. 1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ 1.1. Для проведения исследований па бешенство в лабораторию направляют свежие трупы мелких животных целиком, от крупных животных - - головной мозг. Для постановки биопробы допускается использовать пробы моз­ га. консервированные в 30—50% ном растворе глицерина, !.2. Отобранный для исследования патологический материал упаковывают во влагонепроницаемую тару и в металлических кон­ тейнерах доставляют в лабораторию. 1.3. Патологический материал сопровождают документом, со­ держащим следующие данные: наименование и адрес отправителя; вид животного; анамнестические и клиннко-эпизоотологнческие данные. Издание официальное Перепечатка воспрещена (g) Издательство стандартов, 1984 2
Стр. 2 ГОСТ 26075— >4 2. МЕТОД ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ Сущность метода заключается в соединении меченых антител со специфическим антигеном и наблюдении светящихся комплек­ сов «антитело-антиген» в полях зрения люминесцентного микрос­ копа. 2.1. Аппаратура, материалы, реактивы и растворы Микроскоп люминесцентный. Термостат с температурой нагрева 37°С. Холодильник. Стекла предметные по ГОСТ 9234—75. Пробирки бактериологические по ГОСТ 25336—82. Чашки Петри по ГОСТ 25336—82. Пипетки мерные по ГОСТ 20292—74. Набор инструментов для вскрытия черепной полости и извле­ чения головного мозга животных. Пинцеты по ГОСТ 21241—77. Горелка газовая или спиртовая. Ацетон но ГОСТ 2603—79. Диагностический иммуноглобулин флуоресцирующий антира­ бический (ДАФИ). Масло нефлуоресцирующее иммерсионное по ГОСТ 13739—78. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72. Раствор фосфатный буферный, pH 7,4. 2.2. Подготовка к исследованию 2.2.1. Из каждого отдела головного мозга (аммонова рога, моз­ жечка. коры больших полушарий и продолговатого мозга) готовят по два препарата — мазка-отпечатка. Не допускаются для исследования пробы. консервированные глицерином, фиксированные этиловым спиртом, формалином и дру­ гими средствами, вызывающими денатурацию и разрушение анти­ генов или создающими дополнительный («свой») фон свечения. 2.2.2. Препараты высушивают на воздухе и фиксируют в ох­ лажденном ацетоне при плюс 4 или минус 12°С в течение 4—12 ч. Затем препараты извлекают из ацетона, высушивают на воздухе 10 15 мин и помещают их во влажную камеру (чашки Петри с увлажненным дном). 2.2.3. Диагностический антирабический флуоресцирующий им­ муноглобулин (ДАФИ) в рабочем разведении наносят равномерно иа всю поверхность препарата при помощи пипетки (примерно 0,1 см3 на один препарат), закрывают камеру с препаратами, по­ мешают в термостат и выдерживают 30 мин при 3Т°С. Затем пред­ метные стекла с препаратом троекратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд, наполненный фосфатным
ГОСТ 26075— W Стр. 3 буфером pH 7,4, промывают дистиллированной водой и высу­ шивают на воздухе. На окрашенные препараты наносят иммерсионное нефлуоресцнрующее масло. 2.3. Проведение исследования 2-3.1. Подготовленные препараты просматривают под люминес­ центным микроскопом с иммерсионной системой. 2.4. Обработка результатов 2.4.1. При положительных результатах исследования в препа­ ратах, содержащих антиген вируса бешенства, обнаруживают раз­ ной величины и формы ярко светящиеся желто-зеленым цветом гранулы в нейронах и вне клеток. Размер их колеблется от елва заметных в виде песчинок образований до 15—20 мм Не пораженная вирусом бешенства мозговая нервная ткань све­ тится тусклым серовато-желтым или зеленоватым цветом. 3. МЕТОД ПОДАВЛЕНИЯ ИММУНОФЛУОРССЦЕНЦИИ Сущность метода заключается в способности рабического ан­ тигена, связанного с нефлуоресцирующими антителами, вторично не входить в соединение с флуоресцирующим специфическим коньюгатом. Это свойство используется для доказательства специ­ фичности свечения комплекса «антиген-антнтело> при исследова­ нии препаратов, предварительно не обрабатываемых нефлуорес- цирующимн антителами. 3.1. Аппаратура, материалы, реактивы и растворы 3.1.1- Аппаратура, материалы, реактивы и растворы, указанные в п. 2.1, и дополнительно: иммуноглобулин 5%-иый антирабический нсфлуореспнрующин моноспецифический; раствор физиологический нейтральный. 3.2. Подготовка к исследованию 3.2.1. На фиксированные препараты, приготовленные из иссле­ дуемых участков головного мозга, наносят пипеткой 5%-ный анти­ рабический нефлуоресцирующий моноспецифический иммуногло­ булин, выдерживают их в течение 30 мин во влажной камере в тер­ мостате г.рн 37 °С. Затем препараты промывают двукратно нейт­ ральным физиологическим раствором и окрашивают антираби­ ческим флуоресцирующим иммуноглобулином (ДАФИ) по п. 2.2.3. 3.3. Проведение исследования 3.3.1. Препараты просматривают под люминесцентным микрос­ копом с иммерсионной системой. 3.4. Обработка результатов 3.4.1. В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, предварительно обработанных нефлуоресцирующим и затем флуо-
Cip. 4 ГОСТ Ив75— «4 ресцирующнм иммуноглобулином, свечения не должно быть, а в препаратах, ранее обработанных только флуоресцирующим' им­ муноглобулином наблюдают специфическое свечение. 4. МЕТОД РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ Сущность метода заключается в свойстве антител-прецнпиш- нов и гомологичных им антигенов диффундировать в агаровом ге­ ле и при соединении образовывать видимые визуально линии пре­ ципитатов-комплексов «антитело-антиген». Этим методом допускается исследовать несвежий патологичес­ кий материал, контаминнрованный бактериальный микрофлорой 4.1. Аппаратура, материалы и реактивы Термостат. Баня водяная. Осветитель для бактериологических работ. Пипетки мерные и пастеровские по ГОСТ 20292—74. Чашки Петри по ГОСТ 25336 82. Трубка металлическая тонкостенная диаметром 4—5 мм. Перо писчее ученическое. Натрий хлористый по ГОС Г 4233—77. Метиловый оранжевый, 1%-ный раствоор в 50%-ном этилоном спирте но ГОСТ 5962—67. Мертиолят. Диагностический иммуноглобулин антирабический. Антиген отрицательный контрольный. Антиген положительный контрольный. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72. Гель агаровый биофабрнчного изготовления или приготовлен­ ный по реиептуое: агар-агар «Дифко» или аналогичный - - 15 г, натрии хлористый — 8.5 г, 1%-ный раствор метилового оранжевого в 50%-ном этиловом спирте —10 см3, мертиолят — 0.01 г, вода дистиллированная — 1000 см3. Агаровый гель с pH 7,2—7,4 разливают в стерильную посуду, автоклавируют при 0,5 атм в течение 30 мин, хранят в холодиль­ нике при 4°С. 42. Проведение исследования 4.2.1. Реакцию преципитации (РП) ставят на обезжиренных предметных стеклах, на которые предварительно наносят каплю расплавленного агара, пипеткой равномерно распределяя се по стеклу, и делают тонкий мазок. На застывший слой агара налива­ ют сверху 2.5 см3 агарового геля толщиной приблизительно 2 мм.
ГОСТ 26075— 84 Стр. 5 После застывания агара делают в нем лунки металлической тонкостенной трубочкой диаметром 4—5,6 мм согласно трафарету. Агаровые столбики осторожно извлекают ученическим пером, не допуская отслаивания от стекла тонкого слоя агарового геля. В РП исследуют от крупных животных (лошадей, крупного рогатого скота, собак, лисиц и др.) следующие части головного мозга—кору полушарий левой и правой сторон, аммоновы рога - левый и правый, мозжечок и продолговатый мозг. У мелких живот­ ных РП ставят с какими-либо тремя отделами мозга. От мышей ис­ следуют весь головной мозг, который растирают в ступке или в са­ мой черепной коробке в массу пастообразной консистенции.а ф .1 © с © © Ъ о Ъ о Ъ о © © © © Л 0 * 0 * 0 о Ъ о Ъ о Ъ ® Q[Q ____ ] _ Q __ © 0 0 ©Л кора (левоежмушарас-), Положительная РП со всеянь —кора (правое полушарие); С «миоаов рог (лепи в); Д - а и « о и о » разведениями глобулина рог (прави в); м о ж в ч о *; А — Черт. 2 продолговатый мо»г. /, 3. 3. 4~-п>икя с рвэвеаеяиеигаобупвяасоответственно1:2. 1:4. 1:8. |;1б Черт. I Подготовленные предметные стёкла помещают во влажную ка­ меру (чашки Петри с увлажненным дном) и при постановке реак­ ции лунки заполняют патологическим материалом и диагности­ ческим антирабическим иммуноглобулином (черт. 1—4). В центральные лунки, обозначенные на трафарете А,В,С.Д.Е,Ж, вносят исследуемый патологический материал, в периферические лунки 1,2,3,4. (см. черт. 1) — диагностический антирабический иммуноглобулин (1—2 капли) в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 (от исходного разведения) на физиологическом растворе. Одновременно ставят контрольные опыты с положительными и отрицательным антигенами, но каждый на отдельном стекле, ис­ пользуя тс же разведения иммуноглобулина. После заполнения лунок соответствующими компонентами чаш­ ки Петри (влажные камеры) помещают в термостат при 37°С на 6 ч. Затем выдерживают чашки при комнатной температуре еще 42 ч.
Стр. 6 ГОСТ 2 6 0 7 3 -8 : 0 © © О О!© © Положительная РП с разведеПоложительная РП с рз.тяезе пинии глобулина 1:4, 1:8, 1:16 ннем глобулина 1:16. ©тсутсгЧерт. 3 »ует РП с разнедеииямя' 1:2. 1:4. 1:8 Черт. 4 Реакцию преципитации учитывают через 6, 24. 48 ч после ее пос­ тановки. Предметные стекла просматривают визуально в затемнен­ ной комнате, просвечивая их осветителем снизу вверх под углом 4.3. Обработка результатов 4.3.1. Реакцию считают положительной при появлении одной или двух трех линий приципитации любой интенсивности между лунками, содержащими антиген и иммуноглобулин, 5. МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ ТЕЛЕЦ БАБЕША-НЕГРИ Сущность метода заключается в выявлении в клетках нервной ткани специфических цитоплазматических включений — телец Бабеша-Негри. Метод выявления телец Бабешэ-Негрн является вспомогатель­ ным и имеет диагностическое значение только при обнаружении типичных, специфических включений. 5.1. Аппаратура, материалы и реактивы Микроскоп биологический по ГОСТ 8284—78. Стекла предметные по ГОСТ 9284—75. Пипетки мерные по ГОСТ 20292— 74. Краситель Селлерса. Буфер фосфатный pH 7,0—7,5. 5.2. Подготовка к исследованию 5.2.1. Готовят мазки-отпечатки из аммонового рога, коры боль­ ших полушарий, мозжечка, продолговатого мозга и окрашивают по методу Селлерса. На свежие не высохшие препараты наносят на 10—30 с краси­ тель Селлерса {одну часть 1%-ного раствора основного фуксина смешивают с двумя частями 1%-ного раствора метиленового сине­ го.) После окраски препараты промывают фосфатным буферным
ГОСТ 2 607 J — 84 С тр. 7 раствором и высушивают в вертикальном положении при комнат­ ной температуре. 5.3. Проведение исследования 5-3.1. Препараты просматривают под биологическим микросхопом е иммерсионной системой. 5.4. Обработка результатов 5.4.1. Положительным результатом исследования считают нали­ чие специфических телец. Бабеша-Негри, которые представляют собой четко очерченные овальные или продолговатые гранулиро­ ванные образования диаметром 2—10 мм, розово-красного цве!а, расположенные в нейтронах, а также, вне их. От типичных гранулированных включений, обнаруживаемых при бешенстве, следует отличать включения нсгранулированные, обнаруживаемые при некоторых других инфекциях, поражающих центральную нервную систему. 6. МЕТОД БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ Сущность метода заключается в выделении вируса от больных убитых или павших животных путем инокулнрования патологичес­ кого материала белым мышам и последующей его идентификации. Биопробу проводят, если выявление рабического антигона ме­ тодом нммунофлуоресценцнн (или РП и определение телец Бзбеша-Негрн) в первичном материале окажется отрицательным. 6.1. Аппаратура, материалы и растворы Центрифуга с частотой вращения 2000 об/мин. Пробирки центрифужные. Ступки. Шприцы с иглами. Посуда для содержания мышей. ' Антибиотики (стрептомицин, пенициллин). Раствор нейтральный физиологический. 6.2. Подготовка к исследованию 62.1. Материал для заражения мышей готовят из равных час­ тей нервной ткани лммонова рога, мозжечка, коры полушарий, продолговатого мозга. Ткань измельчают ножницами и растирают в ступке (или гомо­ генизаторе), постепенно прибавляя нейтральный физиологический раствор до получения 10%-ной суспензии. 6.2.2. Суспензию центрифугируют с частотой нращения 2000 об/мин в течение 5—10 мин. Надосадочную жидкость перено­ сят в стерильную пробирку и .хранят в холодильнике при темпе­ ратуре 0—4 °С до ее использования. При подозрении на бактери­ альную нестерильность в суспензию добавляют 500 ME нениниллп.
Стр. 8 ГОСТ 26075— 34 на и 500 ME стрептомицина на I см3 суспензии и затем выдержи­ вают ес при комнатной температуре 30 мин. 6.3. Проведение исследования 6.3.1. Для биопробы берут белых лабораторных мышей мас­ сой 16—20 г или сосунков в возрасте 20—25 сут массой 6—8 г. Мышей заражают подготовленной суспензией нитрацеребрачь- но в дозе 0,015—0,03 см* в зависимости от массы мышей или под­ кожно в верхнюю губу в дозе 0,1—0,2 см*. Па одну бнопробу заражают 6—10 мышей. Зараженных мышей помещают в клетки или банки, на кото­ рые наклеивают этикетку с указанием даты заражения, коли­ чества мышей, способа заражения и номера экспертизы. Горло­ вину банки накрывают сеткой, препятствующей проникновению насекомых. Зараженных мышей осматривают ежедневно в течение 30 сут. Количество здоровых, больных н погибших мышей регистрируют в журнале. 6.4. Обработка результатов 6.4.1. При оценке результатов учитывают проявление клини­ ческих признаков у зараженных мышей: вгьерошенность шерсти; тремор; нарушение координации движения; параличи; прострация; Гибель зараженных мышей в срок до 48 ч не учитывают в оценке результатов. От мышей, павших после указанного срока, головной мозг исследуют, как указано в разд. 2—5. 6.4.2. Биологическую пробу на бешенство считают положи­ тельной, если в препаратах из мозга зараженных мышей обнару­ живают тельца Бабеша-Негри или выявляют антиген методами иммунофлуоресценцин или в реакции преципитации. 6.4.3. Отрицательный диагноз на бешенство может быть дан только по истечении 30-суточной постановки биопробы при отсут­ ствии специфической гибели мышей. 7. МЕТОД СПЕЦИФИЧЕСКОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ Сущность метода заключается в том, что мыши, зараженные мозговой тканью больных бешенством животных, заболевают бешенством, а зараженные тканью, предварительно обработанной антирабической сывороткой (иммуноглобулином), не заболевают. 7.1. Аппаратура, материалы, реактивы и растворы 7.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы, указанные и п. 6.1, и дополнительно:
ГОСТ 26075— М Стр. 9 баня водяная; сыворотка гипериммунная антирабическая (или иммуноглобу­ лин); сыворотка нормальная или физиологический раствор. pH 7,2— 7,4. 7.2. Подготовка к исследованию 7.2.1. Д ля проведения специфической биопробы отбирают 12 белых мышей (п. 6.3.1). Материал для заражения мышей готовят но п. 6.2. 7.2.2. Подготовленную для заражения суспензию разливают в две пробирки по 3 см3. Затем в одну из них вносят 3 см3 анти­ рабическом гипериммунной сыворотки или иммуноглобулин. в другую — 3 см* нормальной сыворотки или физиологический раствор pH 7.2—7,4. Обе пробирки выдерживают в водяной бане в течение 10 мин при 37°С. 7 3. Проведение исследования Каждой смесью заражают по шесть белых мышей интрацеребрально н дозе 0,015—0.03 см3 или в губу в дозе 0,1—0.2 см*. 7.4. Обработка результатов 7.4.1. Положительным на бешенство результатом специфичес­ кой биопробы считают гибель мышей, зараженных материалом, обработанным нормальной сывороткой или физиологическим раст­ вором в течение 30 сут. При этом мыши, инфицированные мате­ риалом после обработки антирабической иммунной сывороткой или иммуноглобулином, должны остаться живыми. 7.4.2. Отрицательный диагноз на бешенство может быть дан только но истечении 30 сут постановки бнопробы, если нет спе­ цифической гибели мышей.
Редактор Р С. Федорова Технический редактор В. Н. Малькоча Корректор И. Б. ЖуховцеваГОСТ 26075-84Слано » ной. 17.0I.JM Подп. . сеч. 15.03.84 0.75 уел. a. a ft7 5 уел. кр.-отт. 062 УХ.-Ц5Л. л.Тираж I60W Цеаа 3 коп.Ордена «Злах Почета» И«датсльст*о стандартов. 12355". М осква, Новопрссксисквв пер., 3.Калужская тнвографжя стандартов. уд. .Московская. 2JO. Зак. 280

ШУ S ' - Л У Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й С Т А Н Д А Р Т С О Ю З А С С Р ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА ГОСТ 26075-84 (СТ СЭВ 3452-81) Издание официальное коп. 3 а н е Ц ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ст_ ........ М осквапромышленная безопасность опасных производственных объектов
РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР ИСПОЛНИТЕЛИ Б. И. А нтоне», л. П. К а м е н е м ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР З ам. начальника Главного управления в етеринарии П. П . Ражманми УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государст- венного комитета СССР по стандартам от 9 января 1984 г. № 48
УДК 636:174.8.07:006.354 Групп* С79 Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й С Т А Н Д А Р Т С О Ю З А С С Р ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ ГОСТ Методы лабораторией диагностики бешенства 2 6 0 7 5 -8 4 Agricultural animals. Methods of labor#ton- diagnostics of rabies (CT СЭВ 3452— 81) О К С Г У 9809 Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 9 января 1984 г. М® 48 срок действия установлен С 01.07.84 д о 01.07.89 ^Несоблюдение стандарта преследуется по закону Настоящий стандарт распространяется на все виды животных и устанавливает методы лабораторной диагностики заболевания бешенством, вызываемого рабдовирусом. Стандарт применяют при диагностике заболевания животных в лабораториях ветеринарных научно-исследовательских учрежде­ ний. республиканских и областных ветеринарных лабораториях Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 3452—81. 1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ 1.1. Для проведения исследований па бешенство в лабораторию направляют свежие трупы мелких животных целиком, от крупных животных - - головной мозг. Для постановки биопробы допускается использовать пробы моз­ га. консервированные в 30—50% ном растворе глицерина, !.2. Отобранный для исследования патологический материал упаковывают во влагонепроницаемую тару и в металлических кон­ тейнерах доставляют в лабораторию. 1.3. Патологический материал сопровождают документом, со­ держащим следующие данные: наименование и адрес отправителя; вид животного; анамнестические и клиннко-эпизоотологнческие данные. Издание официальное Перепечатка воспрещена (g) Издательство стандартов, 1984 2
Стр. 2 ГОСТ 26075— >4 2. МЕТОД ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ Сущность метода заключается в соединении меченых антител со специфическим антигеном и наблюдении светящихся комплек­ сов «антитело-антиген» в полях зрения люминесцентного микрос­ копа. 2.1. Аппаратура, материалы, реактивы и растворы Микроскоп люминесцентный. Термостат с температурой нагрева 37°С. Холодильник. Стекла предметные по ГОСТ 9234—75. Пробирки бактериологические по ГОСТ 25336—82. Чашки Петри по ГОСТ 25336—82. Пипетки мерные по ГОСТ 20292—74. Набор инструментов для вскрытия черепной полости и извле­ чения головного мозга животных. Пинцеты по ГОСТ 21241—77. Горелка газовая или спиртовая. Ацетон но ГОСТ 2603—79. Диагностический иммуноглобулин флуоресцирующий антира­ бический (ДАФИ). Масло нефлуоресцирующее иммерсионное по ГОСТ 13739—78. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72. Раствор фосфатный буферный, pH 7,4. 2.2. Подготовка к исследованию 2.2.1. Из каждого отдела головного мозга (аммонова рога, моз­ жечка. коры больших полушарий и продолговатого мозга) готовят по два препарата — мазка-отпечатка. Не допускаются для исследования пробы. консервированные глицерином, фиксированные этиловым спиртом, формалином и дру­ гими средствами, вызывающими денатурацию и разрушение анти­ генов или создающими дополнительный («свой») фон свечения. 2.2.2. Препараты высушивают на воздухе и фиксируют в ох­ лажденном ацетоне при плюс 4 или минус 12°С в течение 4—12 ч. Затем препараты извлекают из ацетона, высушивают на воздухе 10 15 мин и помещают их во влажную камеру (чашки Петри с увлажненным дном). 2.2.3. Диагностический антирабический флуоресцирующий им­ муноглобулин (ДАФИ) в рабочем разведении наносят равномерно иа всю поверхность препарата при помощи пипетки (примерно 0,1 см3 на один препарат), закрывают камеру с препаратами, по­ мешают в термостат и выдерживают 30 мин при 3Т°С. Затем пред­ метные стекла с препаратом троекратно промывают, погружая их каждый раз на 10 мин в сосуд, наполненный фосфатным
ГОСТ 26075— W Стр. 3 буфером pH 7,4, промывают дистиллированной водой и высу­ шивают на воздухе. На окрашенные препараты наносят иммерсионное нефлуоресцнрующее масло. 2.3. Проведение исследования 2-3.1. Подготовленные препараты просматривают под люминес­ центным микроскопом с иммерсионной системой. 2.4. Обработка результатов 2.4.1. При положительных результатах исследования в препа­ ратах, содержащих антиген вируса бешенства, обнаруживают раз­ ной величины и формы ярко светящиеся желто-зеленым цветом гранулы в нейронах и вне клеток. Размер их колеблется от елва заметных в виде песчинок образований до 15—20 мм Не пораженная вирусом бешенства мозговая нервная ткань све­ тится тусклым серовато-желтым или зеленоватым цветом. 3. МЕТОД ПОДАВЛЕНИЯ ИММУНОФЛУОРССЦЕНЦИИ Сущность метода заключается в способности рабического ан­ тигена, связанного с нефлуоресцирующими антителами, вторично не входить в соединение с флуоресцирующим специфическим коньюгатом. Это свойство используется для доказательства специ­ фичности свечения комплекса «антиген-антнтело> при исследова­ нии препаратов, предварительно не обрабатываемых нефлуорес- цирующимн антителами. 3.1. Аппаратура, материалы, реактивы и растворы 3.1.1- Аппаратура, материалы, реактивы и растворы, указанные в п. 2.1, и дополнительно: иммуноглобулин 5%-иый антирабический нсфлуореспнрующин моноспецифический; раствор физиологический нейтральный. 3.2. Подготовка к исследованию 3.2.1. На фиксированные препараты, приготовленные из иссле­ дуемых участков головного мозга, наносят пипеткой 5%-ный анти­ рабический нефлуоресцирующий моноспецифический иммуногло­ булин, выдерживают их в течение 30 мин во влажной камере в тер­ мостате г.рн 37 °С. Затем препараты промывают двукратно нейт­ ральным физиологическим раствором и окрашивают антираби­ ческим флуоресцирующим иммуноглобулином (ДАФИ) по п. 2.2.3. 3.3. Проведение исследования 3.3.1. Препараты просматривают под люминесцентным микрос­ копом с иммерсионной системой. 3.4. Обработка результатов 3.4.1. В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, предварительно обработанных нефлуоресцирующим и затем флуо-
Cip. 4 ГОСТ Ив75— «4 ресцирующнм иммуноглобулином, свечения не должно быть, а в препаратах, ранее обработанных только флуоресцирующим' им­ муноглобулином наблюдают специфическое свечение. 4. МЕТОД РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ Сущность метода заключается в свойстве антител-прецнпиш- нов и гомологичных им антигенов диффундировать в агаровом ге­ ле и при соединении образовывать видимые визуально линии пре­ ципитатов-комплексов «антитело-антиген». Этим методом допускается исследовать несвежий патологичес­ кий материал, контаминнрованный бактериальный микрофлорой 4.1. Аппаратура, материалы и реактивы Термостат. Баня водяная. Осветитель для бактериологических работ. Пипетки мерные и пастеровские по ГОСТ 20292—74. Чашки Петри по ГОСТ 25336 82. Трубка металлическая тонкостенная диаметром 4—5 мм. Перо писчее ученическое. Натрий хлористый по ГОС Г 4233—77. Метиловый оранжевый, 1%-ный раствоор в 50%-ном этилоном спирте но ГОСТ 5962—67. Мертиолят. Диагностический иммуноглобулин антирабический. Антиген отрицательный контрольный. Антиген положительный контрольный. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709—72. Гель агаровый биофабрнчного изготовления или приготовлен­ ный по реиептуое: агар-агар «Дифко» или аналогичный - - 15 г, натрии хлористый — 8.5 г, 1%-ный раствор метилового оранжевого в 50%-ном этиловом спирте —10 см3, мертиолят — 0.01 г, вода дистиллированная — 1000 см3. Агаровый гель с pH 7,2—7,4 разливают в стерильную посуду, автоклавируют при 0,5 атм в течение 30 мин, хранят в холодиль­ нике при 4°С. 42. Проведение исследования 4.2.1. Реакцию преципитации (РП) ставят на обезжиренных предметных стеклах, на которые предварительно наносят каплю расплавленного агара, пипеткой равномерно распределяя се по стеклу, и делают тонкий мазок. На застывший слой агара налива­ ют сверху 2.5 см3 агарового геля толщиной приблизительно 2 мм.
ГОСТ 26075— 84 Стр. 5 После застывания агара делают в нем лунки металлической тонкостенной трубочкой диаметром 4—5,6 мм согласно трафарету. Агаровые столбики осторожно извлекают ученическим пером, не допуская отслаивания от стекла тонкого слоя агарового геля. В РП исследуют от крупных животных (лошадей, крупного рогатого скота, собак, лисиц и др.) следующие части головного мозга—кору полушарий левой и правой сторон, аммоновы рога - левый и правый, мозжечок и продолговатый мозг. У мелких живот­ ных РП ставят с какими-либо тремя отделами мозга. От мышей ис­ следуют весь головной мозг, который растирают в ступке или в са­ мой черепной коробке в массу пастообразной консистенции.а ф .1 © с © © Ъ о Ъ о Ъ о © © © © Л 0 * 0 * 0 о Ъ о Ъ о Ъ ® Q[Q ____ ] _ Q __ © 0 0 ©Л кора (левоежмушарас-), Положительная РП со всеянь —кора (правое полушарие); С «миоаов рог (лепи в); Д - а и « о и о » разведениями глобулина рог (прави в); м о ж в ч о *; А — Черт. 2 продолговатый мо»г. /, 3. 3. 4~-п>икя с рвэвеаеяиеигаобупвяасоответственно1:2. 1:4. 1:8. |;1б Черт. I Подготовленные предметные стёкла помещают во влажную ка­ меру (чашки Петри с увлажненным дном) и при постановке реак­ ции лунки заполняют патологическим материалом и диагности­ ческим антирабическим иммуноглобулином (черт. 1—4). В центральные лунки, обозначенные на трафарете А,В,С.Д.Е,Ж, вносят исследуемый патологический материал, в периферические лунки 1,2,3,4. (см. черт. 1) — диагностический антирабический иммуноглобулин (1—2 капли) в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 (от исходного разведения) на физиологическом растворе. Одновременно ставят контрольные опыты с положительными и отрицательным антигенами, но каждый на отдельном стекле, ис­ пользуя тс же разведения иммуноглобулина. После заполнения лунок соответствующими компонентами чаш­ ки Петри (влажные камеры) помещают в термостат при 37°С на 6 ч. Затем выдерживают чашки при комнатной температуре еще 42 ч.
Стр. 6 ГОСТ 2 6 0 7 3 -8 : 0 © © О О!© © Положительная РП с разведеПоложительная РП с рз.тяезе пинии глобулина 1:4, 1:8, 1:16 ннем глобулина 1:16. ©тсутсгЧерт. 3 »ует РП с разнедеииямя' 1:2. 1:4. 1:8 Черт. 4 Реакцию преципитации учитывают через 6, 24. 48 ч после ее пос­ тановки. Предметные стекла просматривают визуально в затемнен­ ной комнате, просвечивая их осветителем снизу вверх под углом 4.3. Обработка результатов 4.3.1. Реакцию считают положительной при появлении одной или двух трех линий приципитации любой интенсивности между лунками, содержащими антиген и иммуноглобулин, 5. МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ ТЕЛЕЦ БАБЕША-НЕГРИ Сущность метода заключается в выявлении в клетках нервной ткани специфических цитоплазматических включений — телец Бабеша-Негри. Метод выявления телец Бабешэ-Негрн является вспомогатель­ ным и имеет диагностическое значение только при обнаружении типичных, специфических включений. 5.1. Аппаратура, материалы и реактивы Микроскоп биологический по ГОСТ 8284—78. Стекла предметные по ГОСТ 9284—75. Пипетки мерные по ГОСТ 20292— 74. Краситель Селлерса. Буфер фосфатный pH 7,0—7,5. 5.2. Подготовка к исследованию 5.2.1. Готовят мазки-отпечатки из аммонового рога, коры боль­ ших полушарий, мозжечка, продолговатого мозга и окрашивают по методу Селлерса. На свежие не высохшие препараты наносят на 10—30 с краси­ тель Селлерса {одну часть 1%-ного раствора основного фуксина смешивают с двумя частями 1%-ного раствора метиленового сине­ го.) После окраски препараты промывают фосфатным буферным
ГОСТ 2 607 J — 84 С тр. 7 раствором и высушивают в вертикальном положении при комнат­ ной температуре. 5.3. Проведение исследования 5-3.1. Препараты просматривают под биологическим микросхопом е иммерсионной системой. 5.4. Обработка результатов 5.4.1. Положительным результатом исследования считают нали­ чие специфических телец. Бабеша-Негри, которые представляют собой четко очерченные овальные или продолговатые гранулиро­ ванные образования диаметром 2—10 мм, розово-красного цве!а, расположенные в нейтронах, а также, вне их. От типичных гранулированных включений, обнаруживаемых при бешенстве, следует отличать включения нсгранулированные, обнаруживаемые при некоторых других инфекциях, поражающих центральную нервную систему. 6. МЕТОД БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ Сущность метода заключается в выделении вируса от больных убитых или павших животных путем инокулнрования патологичес­ кого материала белым мышам и последующей его идентификации. Биопробу проводят, если выявление рабического антигона ме­ тодом нммунофлуоресценцнн (или РП и определение телец Бзбеша-Негрн) в первичном материале окажется отрицательным. 6.1. Аппаратура, материалы и растворы Центрифуга с частотой вращения 2000 об/мин. Пробирки центрифужные. Ступки. Шприцы с иглами. Посуда для содержания мышей. ' Антибиотики (стрептомицин, пенициллин). Раствор нейтральный физиологический. 6.2. Подготовка к исследованию 62.1. Материал для заражения мышей готовят из равных час­ тей нервной ткани лммонова рога, мозжечка, коры полушарий, продолговатого мозга. Ткань измельчают ножницами и растирают в ступке (или гомо­ генизаторе), постепенно прибавляя нейтральный физиологический раствор до получения 10%-ной суспензии. 6.2.2. Суспензию центрифугируют с частотой нращения 2000 об/мин в течение 5—10 мин. Надосадочную жидкость перено­ сят в стерильную пробирку и .хранят в холодильнике при темпе­ ратуре 0—4 °С до ее использования. При подозрении на бактери­ альную нестерильность в суспензию добавляют 500 ME нениниллп.
Стр. 8 ГОСТ 26075— 34 на и 500 ME стрептомицина на I см3 суспензии и затем выдержи­ вают ес при комнатной температуре 30 мин. 6.3. Проведение исследования 6.3.1. Для биопробы берут белых лабораторных мышей мас­ сой 16—20 г или сосунков в возрасте 20—25 сут массой 6—8 г. Мышей заражают подготовленной суспензией нитрацеребрачь- но в дозе 0,015—0,03 см* в зависимости от массы мышей или под­ кожно в верхнюю губу в дозе 0,1—0,2 см*. Па одну бнопробу заражают 6—10 мышей. Зараженных мышей помещают в клетки или банки, на кото­ рые наклеивают этикетку с указанием даты заражения, коли­ чества мышей, способа заражения и номера экспертизы. Горло­ вину банки накрывают сеткой, препятствующей проникновению насекомых. Зараженных мышей осматривают ежедневно в течение 30 сут. Количество здоровых, больных н погибших мышей регистрируют в журнале. 6.4. Обработка результатов 6.4.1. При оценке результатов учитывают проявление клини­ ческих признаков у зараженных мышей: вгьерошенность шерсти; тремор; нарушение координации движения; параличи; прострация; Гибель зараженных мышей в срок до 48 ч не учитывают в оценке результатов. От мышей, павших после указанного срока, головной мозг исследуют, как указано в разд. 2—5. 6.4.2. Биологическую пробу на бешенство считают положи­ тельной, если в препаратах из мозга зараженных мышей обнару­ живают тельца Бабеша-Негри или выявляют антиген методами иммунофлуоресценцин или в реакции преципитации. 6.4.3. Отрицательный диагноз на бешенство может быть дан только по истечении 30-суточной постановки биопробы при отсут­ ствии специфической гибели мышей. 7. МЕТОД СПЕЦИФИЧЕСКОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ Сущность метода заключается в том, что мыши, зараженные мозговой тканью больных бешенством животных, заболевают бешенством, а зараженные тканью, предварительно обработанной антирабической сывороткой (иммуноглобулином), не заболевают. 7.1. Аппаратура, материалы, реактивы и растворы 7.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы, указанные и п. 6.1, и дополнительно:
ГОСТ 26075— М Стр. 9 баня водяная; сыворотка гипериммунная антирабическая (или иммуноглобу­ лин); сыворотка нормальная или физиологический раствор. pH 7,2— 7,4. 7.2. Подготовка к исследованию 7.2.1. Д ля проведения специфической биопробы отбирают 12 белых мышей (п. 6.3.1). Материал для заражения мышей готовят но п. 6.2. 7.2.2. Подготовленную для заражения суспензию разливают в две пробирки по 3 см3. Затем в одну из них вносят 3 см3 анти­ рабическом гипериммунной сыворотки или иммуноглобулин. в другую — 3 см* нормальной сыворотки или физиологический раствор pH 7.2—7,4. Обе пробирки выдерживают в водяной бане в течение 10 мин при 37°С. 7 3. Проведение исследования Каждой смесью заражают по шесть белых мышей интрацеребрально н дозе 0,015—0.03 см3 или в губу в дозе 0,1—0.2 см*. 7.4. Обработка результатов 7.4.1. Положительным на бешенство результатом специфичес­ кой биопробы считают гибель мышей, зараженных материалом, обработанным нормальной сывороткой или физиологическим раст­ вором в течение 30 сут. При этом мыши, инфицированные мате­ риалом после обработки антирабической иммунной сывороткой или иммуноглобулином, должны остаться живыми. 7.4.2. Отрицательный диагноз на бешенство может быть дан только но истечении 30 сут постановки бнопробы, если нет спе­ цифической гибели мышей.
Редактор Р С. Федорова Технический редактор В. Н. Малькоча Корректор И. Б. ЖуховцеваГОСТ 26075-84Слано » ной. 17.0I.JM Подп. . сеч. 15.03.84 0.75 уел. a. a ft7 5 уел. кр.-отт. 062 УХ.-Ц5Л. л.Тираж I60W Цеаа 3 коп.Ордена «Злах Почета» И«датсльст*о стандартов. 12355". М осква, Новопрссксисквв пер., 3.Калужская тнвографжя стандартов. уд. .Московская. 2JO. Зак. 280

Похожие документы