Все госты и снипы онлайн

Более 10000 документов в открытом доступе, абсолютно бесплатно

ГОСТ 33634-2015 - Продукты пищевые, продовольственное сырье. Иммуноферментный метод определения остаточного содержания антибиотиков фторхинолонового ряда

Этот документ был распознан автоматически. В блоке справа Вы можете найти скан-копию. Мы работаем над ручным распознаванием документов, однако это титанический труд и на него уходит очень много времени. Если Вы хотите помочь нам и ускорить обработку документов, Вы всегда можете сделать это, пожертвовав нам небольшую сумму денег.

Файлы для печати:

М Е Ж Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й С О В Е Т П О С Т А Н Д А Р Т И З А Ц И И , М Е Т Р О Л О Г И И И С Е Р Т И Ф И К А Ц И И (М ГС ) IN T E R S T A T E C O U N C IL F O R S T A N D A R D IZ A T IO N , M E T R O L O G Y A N D C E R T IF IC A T IO N (IS C ) ГОСТ М Е Ж Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й 33634 С Т А Н Д А Р Т — 2015 ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ И м м уноф ерм ентны й метод определения остаточного содержания антибиотиков ф тор хи но л о но во го ряда Издание о ф и ц и аль н о е Москва Стандартинформ 2016технические условия скачать
Г О С Т 33634— 2015 Предисловие Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандар­ тизации установлены Г О С Т 1.0— 92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положе­ ния» и Г О С Т 1.2— 2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила раз­ работки, принятия, применения, обновления и отмены» С в е де н и я о стандарте 1 Р А З Р А Б О ТА Н Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский госу­ дарственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств д л я животных и кормов» (Ф ГБ У «В Г Н К И ») 2 В Н Е С Е Н Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстанда р т) 3 П Р И Н Я Т Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (про­ токол от 27 октября 2015 г. № 8 1 -П ) За принятие проголосовали: Краткое наименование страны Код страны Сокращенное наименование национального органа no МК (ИСО 3166)004-97 по МК (ИСО 3166)004-97 по стандартизации Армения AM Минэкономики Республики Армения Киргизия KG Кыргызстандарт Россия RU Росстандарт 4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 января 2016 г. N9 6-ст межгосударственный стандарт Г О С Т 33634— 2015 введен в действие в качестве нацио­ нального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г. 5 В В Е Д Е Н В П Е Р В Ы ЕИнформация об изменениях к настоящему с та н д а р т у публикуется в ежегодном информацион­ном указателе « Национальные ста н д а р ты », а т е к с т изменений и поправок — в ежемесячном инфор­ мационном указателе « Национальные с та н да р ты ». В случае пересмотра (замены) или отменынастоящ его с та н д а р та соответствую щ ее уведомление б у д е т опубликовано в ежемесячноминформационном указателе «Национальные ста н д а р ты ». С о о тве тствую щ а я информация, уве­ домление и т е к с т ы размещаются также в информационной системе общего пользованияна офи­ циальном са й те Федерального а ге н тс тв а по техническому регулированию и м етрологии в с е тиИ н т е р н е т © Стандартинформ. 2016 В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизве­ ден. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
Г О С Т 33634— 2015 Содержание 1 О бласть применения.................................................................................................................................................... 1 2 Нормативные с с ы л к и ..................................................................................................................................................1 3 Термины, определения и сокращения.................................................................................................................... 2 4 Сущность м е то да .......................................................................................................................................................... 2 5 Метрологические характеристики.............................................................................................................................2 6 Требования безопасности и условия выполнения изм ерений........................................................................ 3 7 Средства измерений, аппаратура, материалы, посуда и реактивы............................................................... 3 8 Подготовка к выполнению измерений.................................................................................................................... 4 8.1 Подготовка оборудования.................................................................................................................................. 4 8.2 Приготовление растворов.................................................................................................................................. 4 8.3 О тбор п р о б .............................................................................................................................................................5 8.4 Подготовка п р о б .................................................................................................................................................... 5 9 Проведение иммуноферментного а н али за........................................................................................................... 6 9.1 Общие п о ло ж е н и я .............................................................................................................................................. 6 9.2 Подготовка тест-системы к проведению а н а ли з а .......................................................................................6 9.3 Проведение и спы тания.................................................................................................. 7 10 Обработка результатов измерения..................................................................................................................... 7 11 Контроль точности результатов измерения. ....................................................................................................8 Приложение А (рекомендуемое) Комплектация тест-системы «Фторхииолоны И Ф А » ..............................9 Приложение Б (рекомендуемое) Схема заполнения лунок планш ета...........................................................10 Приложение В (рекомендуемое) Таблица д л я записи результатов измерения......................................... 11 in
ГОСТ 33634—2015 М Е Ж Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н Ы Й С Т А Н Д А Р Т П Р О Д У К Т Ы П И Щ Е В Ы Е , П Р О Д О В О Л Ь С Т В Е Н Н О Е С Ы Р Ь Е Имм уноферм ентны й м ето д о п р еде ле ни я о статоч но го содерж ания антибиотиков ф то р х и н о ло н о в о го ряда Food products, food raw materials. Immunoenzymatlc method for determination of fluoroquinolones residual content Дата введения — 2017— 01— 01 1 Область применения Настоящий стандарт распространяется на мясо, мясо птицы, яйца, яичный меланж, яичный поро­ шок. молоко и устанавливает иммуноферментный метод определения остаточного содержания антиби­ отиков фторхинолонового ряда (энроф локсаци на. ципрофлоксацина. норфлоксацина и офлоксацина) в диапазоне измерений от 5 до 1280 мкг/кг. 2 Нормативные ссылки В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты: Г О С Т 12.1.004— 91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования Г О С Т 12.1.007— 76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности Г О С Т 12.1.019— 791 * Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие тре­ бования и номенклатура видов защиты Г О С Т O IM L R 76-1— 2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания Г О С Т 245— 76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия Г О С Т 334— 73 Бумага масштабно-координатная. Технические условия Г О С Т 1770— 74 (И С О 1042— 83, И С О 4788— 80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры , мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия Г О С Т 2652— 78 Реактивы. Калия бихромат технический. Технические условия Г О С Т 4172— 76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия Г О С Т 4204— 77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия Г О С Т 4233— 77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия Г О С Т 4328— 77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия Г О С Т И С О 5725-6— 20032> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике ’ ’ В Российской Федерации действует Г О С Т Р 12.1.019— 2009 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты». ‘ В Российской Федерации действует Г О С Т Р И С О 5725-6— 2002 «Точность (правильность и прецизион­ ность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике*. Издание оф ициальное 1
Г О С Т 33634— 2015 Г О С Т 6552— 80 Реактивы. Кислота ортофосформая. Технические условия Г О С Т 6709— 72 Вода дистиллированная. Технические условия Г О С Т 7269— 79 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения све­ жести Г О С Т 12026— 76 Бумага ф ильтровальная лабораторная. Технические условия Г О С Т 25336— 82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры Г О С Т 26809— 86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу Г О С Т 31467— 2012 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям П р и м е ч а н и е — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылоч- ныхстандартовпо указателю «Национальныестандарты».составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным а текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (изменен­ ным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, а котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку 3 Термины, определения и сокращения 3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определения­ ми: 3.1.1 те ст-с и с те м а : Набор (комплект) специально подобранных реагентов (реактивов) и состав­ ных частей, предназначенный д л я определения одного или нескольких конкретных веществ. 3.1.2 всп о м о га те льн ы й р а ств о р : Раствор, приготовляемый заблаговременно и необходимый д л я приготовления других типов растворов. 3.1.3 рабочий р а ств о р : Раствор одного или нескольких реактивов, приготовляемый непосре­ дственно перед использованием и необходимый д л я выполнения процедуры анализа. 3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения: ИФА — иммуноферментмый анализ; О П — оптическая плотность; А Г — антиген; А Т — антитела; ФК — ферментный конъюгат; П — относительное поглощение. 4 Сущность метода 4.1 Иммуноферментный метод основан на измерении содержания фторхинолонов в растворах экстрактов исследуемых проб с помощью непрямого твердофазного конкурентного ИФА. 4.2 Непрямой твердофазный конкурентный ИФ А основан на способности антибиотиков фторхинолонового ряда взаимодействовать со специфичными А Т . полученными к энрофлоксацину. в условиях конкуренции с белковым конъюгатом энрофлоксацина, нанесенным на поверхность лунок планше­ та, — твердофазным А Г. 4.3 Связавшиеся с твердой фазой А Т взаимодействуют с вторичными антивидовыми А Т . мечен­ ными пероксидазой хрена, которые выявляют путем измерения интенсивности окрашивания продукта реакции окисления З.З'.б.б'-тетраметилбензидина (раствор N9 11, см. приложение А ) перекисью водорода. Аналитический сигнал (регистрируемое значение О П ), характеризующий степень взаимодействия А Т с А Г . обратно пропорционален массовой концентрации фторхинолонов в исследуемом растворе. 5 Метрологические характеристики 5.1 Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает определение содержания анти­ биотиков фторхинолонового ряда с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата к = 2. указанной в таблице 1. 2
Г О С Т 33634— 2015 Т а б л и ц а 1 — Метрологические характеристики Значение относи­ Показатель воспро­ Диапазон из­ тельной расширен­ Показатель повторяе­ изводимости (отно­ Предел по­ мерений со­ ной мости (относительное вторяемости сительное Содержание фторхинолонов держания. неопределенности среднеквадратичес- стандартное откло­ г. % (при мкг/дм3 (мм/ 1/. при коэффициен­ кое отклонение повто­ нение воспроизво­Р * 0.95. кг) те охвата к * 2. ряемости) af, % димости)п « 2)пп, %Р ш 0.95. % В мясе, мясе птицы, яйцах, яичном порошке, яичном меланже, молоке 5— 1280 75 13 35 36 5.2 Специфичность А Т , применяемых д л я определения содержания фторхинолонов. выраженная в коэффициентах перекрестного реагирования, представлена в таблице 2. Т а б л и ц а 2 — Специфичность А Т. применяемых для определения массовой концентрации фторхинолонов Фторхииопои Коаффициент перекрестного реагирования. % Энрофлоксацин 100 Ципрофлоксацин 100 Норфлоксацин 60 Офлоксацин 20 6 Требования безопасности и условия выполнения измерений 6.1 При выполнении измерений необходимо соблю дать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по Г О С Т 12.1.007. 6.2 Помещения, в которых проводится анализ и подготовка проб, должны быть оборудованы при­ точно-вытяжной вентиляцией, и соответствовать требованиям пожарной безопасности по Г О С Т 12.1.004 и электробезопасности по Г О С Т 12.1.019. 6.3 К выполнению измерений допускаются лица, владеющие техникой И Ф А и изучившие инструк­ цию по применению тест системы и инструкции по эксплуатации используемых приборов. 6.4 При выполнении измерений соблюдают следующие условия: - температура окружающего в о з д у х а ............................................................................... от 20 "С д о 30 °С; - атмосферное д а в л е н и е ...................................................................................................... от 84 д о 106 кПа; - напряжение в питающей электросети............................................................................... от 200 д о 240 В; - частота переменного т о к а .......................................................................................................от 49 д о 51 Гц; - относительная влажность в о з д у х а .................................................................................. от 40 % до 80 % . 7 Средства измерений, аппаратура, материалы, посуда и реактивы 7.1 При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, аппаратуру, матери­ алы и посуду: - весы неавтоматического действия высокого класса точности п о Г О С Т O IM L R 7 6 -1 с наибольшим пределом взвешивания не более 150 г и пределом допускаемой абсолютной погрешности i0 ,0 5 г; - весы микроаналитические с наибольшим пределом взвешивания 52 г. с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более 10,01 мг; - калькулятор любого типа с логарифмической функцией; - pH-метр любой марки, позволяющий проводить измерения в диапазоне от 3 до 10 ед. pH с погреш­ ностью ±0,05 ед. pH; - фотометр вертикального типа фотометрирования с диапазоном измерений О П от 0 до 3 в ком­ плекте с интерференционными светофильтрами д л я д ли н волн 450 и 620 нм; з
Г О С Т 33634— 2015 - измельчитель-гомогенизатор лабораторный; - морозильную камеру любого типа, обеспечивающую среднюю температуру в холодильной каме­ ре не выше минус 20 °С; - роторный испаритель любого типа или устройство д л я испарения экстрактов, термостатируемый нагревательный м одуль с системой отдувки растворителей инертным газом; - термостат любого типа, поддерживающий температуру (37 ± 1) °С; - холодильник бытовой с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном темпера­ тур о т О ° С д о 8 ° С ; - центрифугу с бакет-ротором и адаптером д л я пробирок вместимостью 15 см3, частотой вращения не менее 4000 об/мин; -ш ейкер вортексного типа, с вставкой д л я одной пробирки и диапазоном скорости от 150 до 2500 об/мин; - шейкер переворачивающий вертикального вращения 360° в одной плоскости с адаптером д ля пробирок и диапазоном скорости от 20 до 100 об/мин; - шкафсушильныйлюбоготипа.обеспечиаающий поддержание температуры не менее (95 ± 5 )° С ; - бумагу масштабно-координатную по Г О С Т 334. марки Н -1 ; - бумагу фильтровальную по Г О С Т 12026: - колбы 1-10(100, 1000>-2 по Г О С Т 1770, - колбу типа Кн-1-50-24/29 Т С по Г О С Т 25336; - пипетки многоканальные переменной вместимости 0.03— 0,3 см3, с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более ±1.0 % ; - пипетки одноканальные переменной вместимости 20— 100 мм3, 200— 1000 мм3, 500— 5000 мм3 с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более ^1 % ; - пробирки полипропиленовые вместимостью 15 см3 с завинчивающимися крышками; - пробирки типа П-1-10-0.1 Х С по Г О С Т 25336; - пробирки типа «Э п п е н до р ф » вместимостью 1,5 см3; - цилиндры 1(2.3}-100(250)-1 по Г О С Т 1770. 7.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы: - ацетонитрил д л я хроматографии, о. с. ч.. с массовой долей основного вещества не менее 99.9 % ; - воду дистиллированную по Г О С Т 6709; - гексан с содержанием основного вещества не менее 98 % , х. ч.; - дихлорметан д л я газовой хроматографии с массовой долей основного вещества не менее 99.9 % ; - калия бихромат по Г О С Т 2652; - кислоту ортофосфорную по Г О С Т 6552. концентрированную, х. ч.; - кислоту серную по Г О С Т 4204, концентрированную; - натрия гидроксид по Г О С Т 4328. х. ч.; - натрия гидрофосфат безводный, х.ч., п о Г О С Т 4172; - натрия дигидрофосф ат 2-водный, ч. д . а., по Г О С Т 245; - натрий хлористый по Г О С Т 4233, х. ч.; - тест-систему д л я непрямого твердофазного конкурентного ИФА. укомплектованную в соотве­ тствии с приложением А. 8 П о д г о т о в к а к в ы п о л н е н и ю и з м е р е н и й 8.1 П одготовка об о р удо ва ни я 8.1.1 При подготовке к проведению измерений лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу. 8.1.2 Подготовку и проверку фотометра, pH-метра проводят в соответствии с руководствами по эксплуатации приборов. 8.2 П р и го то в ле ни е р аство р о в 8.2.1 П р и го то в ле ни е раствора ф о с ф о р н о й к и сло ты м оля рной концентрацией 1 м оль/дм 3 В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 50 см3 дистиллированной воды и осторожно прили­ вают 12 см3 концентрированной фосфорной кислоты, доводят объем раствора дистиллированной водой д о метки, закрывают пробкой и тщ ательно перемешивают. Срок хранения раствора в вытяжном шкафу при комнатной температуре — не более 1 мес. 4
Г О С Т 33634— 2015 8.2.2 П р и го то в ле ни е ф о с ф а тн о го б уф е р н о го р аствора м оля рной концентрацией 0,067 моль/дм 3 и pH 7,2 В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 7,67 г безводного гидрофосфата натрия. 2.02 г 2-водного дигидрофосфата натрия и 8.7 г хлорида натрия, растворяют в 500 см3 дистиллированной воды. Измеряют pH. устанавливают его значение до 7,2 ♦. 0.2, осторожно по каплям прибавляя раствор фосфорной кислоты (см. 8.2.1) и постоянно перемешивая. Затем объем в колбе доводят д о мотки ди с­ тиллированной водой. Срок хранения раствора при температуре 4 "С — не более 1 мес. 8.2.3 П р и го то в ле ни е раствора ги др о к с и да натрия м о ля р н о й концентрацией 0,1 м оль/дм 3 В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0.4 г гидроксида натрия, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой. Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес. 8.2.4 П р и го то в ле ни е рабочего б уф е р н о го раствора В мерную колбу вместимостью 10 см3 приливают д о метки раствор № 10 (см. приложение А ), добав­ ляю т 28 мм3 раствора Ne 13 (см. приложение А ), перемешивают и закрывают притертой пробкой. Используют свежеприготовленный раствор. 8.2.5 П р и го то в ле ни е смеси а ц е то н и тр и ла и раствора ги др о к с и да натрия м оля рной концентрацией 0,1 м оль/дм 3 В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 90 см3 ацетонитрила и доводят до метки раствором гидроксида натрия (см. 8.2.3). Колбу закрывают пробкой и тщ ательно перемешивают. Срок хранения раствора при комнатной температуре в вытяжном шкафу — 2 сут. 8.2.6 П р и го то в ле ни е рабочих гр а дуи р о в о ч н ы х р а ств о р о в К0— К5 Д л я приготовления рабочего разведения градуировочных растворов Kq— ^ в пробирки типа «Э п п е н до р ф ». маркированные К0, К ,. К3, К4 и К5. вносят по 0.27 см3 рабочего буферного раствора (см. 8.2.4) и по 0,03 см3 реактивов No 3— No 8 (см. приложение А), соответственно маркировке. Перемеши­ вают. в результате получают растворы со следующими концентрациями энрофлоксацина: К0— Омкг/см3;К , — 0 ,5 мкг/с м 3;К2 — 2,0мкг/см3;К 3 — 8,0мкг/см3;К4 — 32.0мкг/см3;К5 — 128.0мкг/см3. Используют свежеприготовленные растворы. Концентрированные градуировочные растворы после вскрытия флаконов хранят при температуре от 2 °С до 8 °С в течение всего срока годности набора. 8.2.7 П р и го то в ле ни е рабочего раствора б уф ера д л я промывки В колбу вместимостью 50 см3 вносят 47.5 см3 дистиллированной воды, добавляю т 2.5 см3 реактива No 2 (см. приложение А ), перемешивают. Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 8 =С не более — 1 мес. 8.2.8 П р и го то в ле ни е рабочего раствора ф ерм ентно го конъю гата В стеклянную пробирку вносят 2,25 см3 реактива No 10 (см. приложение А ) и 0.25 см3 реактива No 9 (см. приложение А ), перемешивают. Используют свежеприготовленный раствор. 8.3 О тб о р проб 8.3.1 О тбор проб мяса и мясных продуктов — по Г О С Т 7269. 8.3.2 О тбор проб мяса птицы — по Г О С Т 31467. 8.3.3 О тбор проб молока — по Г О С Т 26809. 8.3.4 О тбор проб яиц. яичного меланжа и яичного порошка проводят по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт. 8.3.5 Срок хранения отобранных проб при температуре от 2 °С до 8 °С — 2 сут. При отсутствии воз­ можности исследования проб в течение двух суток они должны быть заморожены при температуре минус 20 °С со сроком хранения не более двух месяцев. 8.4 П одготовка проб 8.4.1 П одготовка проб мяса, мяса пти ц ы , яиц, яичного меланжа, яичного порошка Яйца отделяю т от скорлупы и перемешивают на гомогенизаторе. Яичный меланж, яичный порошок тщ ательно перемешивают. Мышечную ткань предварительно очищают от жира, грубой соединительной ткани и измельчают на гомогенизаторе. Д алее обработку пробы проводят в соответствии с рисунком 1. 5
Г О С Т 33634— 2015 2.00 г гомогенизированной пробы помещают в попипропиленоаую пробирку вместимостью 15 см3. Вносят 8 см3 смеси ацетонитрила и раствора натрия гидроксида (см. 8.2.5). перемешивают в течение 2 мин на шейкере вортексного типа, после чего перемешивают на переворачивающем шейкере в течение 10 мин Центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин при температуре 15 ‘ С ♦ 3 см3 надосадочной жидкости переносят в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 смл, добавляют 3.0 см5 фосфатного буферного раствора (см. 8.2.2) и 6 см3 дихлорметана. Перемешивают на переворачивающем шейкере в течение 10 мин Центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин при температуре 15 ‘ С Удаляют верхний водный слой и промежуточную фазу. Переносят 3 см3 нижнего органического слоя в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3 и упаривают досуха в токе азота в системе упаривания при температуре 50 "С К сухому остатку добавляют 0.3 см3 раствора N9 3 (см. приложение А ) и тщательно перемешивают на шейкере вортексного типа до полного растворения * Полученный экстракт обезжиривают. Д ля этого приливают 0.3 см3 гексана и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин при температуре 15 ‘ С . Удаляют верхний гексановый слой. Процедуру обезжиривания повторяют еще раз * В пробирку типа «Эппендорф» отбирают 0.03 см' обезжиренного экстракта, добавляют 0.27 см3 рабочего буферного раствора (см. 8.2.4), перемешивают и используют для проведении ИФА в соответствии с разделом 9 Рисунок 1 — Обработка испытуемых проб 8.4.2 П одготовка проб молока Отобранную пробу молока перед анализом тщ ательно перемешивают. В полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3 вносят 2 см3 пробы. 8 см3 смеси ацетонитрила и раствора натрия гидроксида (см. 8.2.5), гомогенизируют в течение 2 мин. после чего перемешивают на шейкере вортексного типа в течение 10 мин. Д алее процедуру экстракции и обезжиривания пробы прово­ д я т согласно рисунку 1. 9 Проведение иммуноферментного анализа 9.1 О бщ и е полож ения 9.1.1 При проведении испытаний следует использовать реагенты и компоненты, входящие в один и тот же набор (тест-систему). Разбавление или замена реагентов из набора (тест-системы) другой серии не допускается. 9.1.2 Наборы (тест-системы) следует хранить при температуре от 2 °С до 8 вС в пределах срока хранения. 9.1.3 Окрашивание раствора субстрата № 11 (см. приложение А ) является признаком его порчи и д е ла е т невозможным его применение д л я анализа. 9.2 П одготовка тест-си стем ы к пр о ве де н и ю анализа 9.2.1 Перед использованием тест-систему вынимают из холодильника и выдерживают при ком­ натной температуре не менее 30 мин. после чего аккуратно встряхивают каждый ф лакон. Реактив № 2 (см. приложение А ) необходимо прогреть в сушильном шкафу при температуре 37 °С до полного раство­ рения кристаллов солей и тщ ательно перемешать. 9.2.2 После использования, реагенты тест-системы сразу помещают в холодильник. 6
Г О С Т 33634— 2015 9.2.3 На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света. 9.2.4 Д л я каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники автомати­ ческих пипеток. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок. 9.2.5 Каждый исследуемый рабочий раствор экстрактов испытуемых проб анализируют в двух повторностях. П р и м е ч а н и е — Далее приведены расходы реактивов на два стр и ла Ч что достаточно для анализадвух исследуемых проб. Д ля другого числа проб количество используемых стрилоа и смешиваемых объемов реагентов изменяют в соответствии с количеством исследуемых проб. 9.3 П роведение и спы тания 9.3.1 Из планшета извлекают необходимое число стрипов. Неиспользованные стрипы хранят в закрытом фольгированном полиэтиленовом пакете с зип-локом2) при температуре от 2 °С д о 8 °С в тече­ ние срока годности тест-системы. 9.3.2 В лунки планшета вносят по 0.05 см3 рабочих градуировочных растворов (8.2.6) и по 0,05 см3 растворов экстрактов испытуемых проб. Каждый раствор вносят в двойной повторности (лунки-дубли). Внесение растворов проводят согласно приложению Б. Д а ле е в каждую лунку вносят по 0,05 см3 раствора No 1 (см. приложение А ). Стрипы заклеивают пленкой или закрывают крышкой, инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 1 ч. после чего содержимое лунок сливают. 9.3.3 В лунки планшета вносят по 0.2 см3 раствора буфера д л я промывки (см. 8.2.7), оставляю т на 1— 2 мин и сливают. Процедуру промывки повторяют еще три раза. Остатки жидкости интенсивно стря­ хивают на чистую фильтровальную бумагу. 9.3.4 В лунки планшета вносят по 0.1 см3 раствора ферментного конъюгата (см. 8.2.8). заклеивают пленкой или закрывают крышкой, инкубируют в термостате при температуре 37 вС 1 ч и отмывают, как указано в 9.3.3. 9.3.5 В лунки планшета вносят по 0,1 см3 раствора № 11 (см. приложение А ) и инкубируют при ком­ натной температуре в темноте в течение 15 мин. Добавляю т 0,1 см3 раствора No 12 (см. приложение А ) и аккуратно перемешивают легким постукиванием по ребру планшета. Помещают планш ет в вертикаль­ ный фотометр и измеряют значения О П при дли н е волны 450 нм. Запись результатов проводят согласно приложению В. 10 Обработка результатов измерения 10.1 По показателям О П в лунках-дублях находят среднеарифметические значения. Разность значений О П д л я них в процентах от среднего не должна превышать 10. Связывание А Т (или относительное поглощение) П. % . рассчитывают по формуле ОП,: П = ■100, ( 1) О П к где О П п — среднее значение О П . измеренной в лунках с градуировочными растворами энрофлоксацина К ,— К5 (см. 8.2.6) или рабочими растворами экстрактов испытуемых проб; О П к — среднее значение О П. измеренной в лунках с градуировочным раствором Kg (с м . 8.2.6). По значениям процентов связывания, вычисленным д л я градуировочных растворов исоответству- ющим известным значениям массовой концентрации энрофлоксацииа (мкг/дм3). строят градуировоч­ ный график в полулогарифмической системе координат. 10.2 Д л я построения градуировочного графика используют масштабно-координатную бумагу. На ось абсцисс наносят значения логарифмов концентраций энрофлоксацииа в рабочих разведениях гра­ дуировочных растворов (см. 8.2.6). По оси ординат откладывают значения процентов связывания, рас­ считанные д л я массовых концентраций по ф орм уле (1), и строят градуировочный график с использованием линейной зависимости. ' ' Стрип — полоске из восьми лунок. 2 ’ Зил-лок — замок, обеспечивающий герметизацию пакета. 7
Г О С Т 33634— 2015 10.3 С помощью градуировочного графика по значению процента связывания, полученного д ля рабочих растворов экстрактов испытуемых проб, находят логарифм массовой концентрации фторхинолонов. С помощью калькулятора вычисляют его обратное значение (антилогарифм), соответствующее массовой концентрации определяемого фторхинолона в растворе экстракта. После чего рассчитывают содержание фторхинолонов в пробе С. мкг/дм3 (мкг/кг), по формуле С = с • К. (2) где с — массовая концентрация фторхинолонов в рабочем растворе экстракта испытуемой пробы, определяемая по градуировочному графику, мкг/дм3;К — коэффициент пересчета мкг/дм3 в рабочем растворе экстракта испытуемой пробы в мкг/дм3 (мкг/кг). учитывающий как разведение, так и степень извлечения фторхинолонов и равный 10. Результаты измерений массовой концентрации (содержания) фторхинолонов С. мкг/дм3 (мкг/кг), округляют д о целого числа. За окончательный результат принимают среднеарифметическое двух измерений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости |С,— С 2| £0.01 • Сср г, (3) где С , и С 2 — результаты определений содержания фторхинолонов, полученные в условиях повторяе­ мости. мкг/кг, Сср — среднеарифметическое результатов двухопределений содержания фторхинолонов в про­ бе. мкг/кг;г — предел повторяемости, % , (см. таблицу 1). 10.4 Допускается использование программного обеспечения, позволяющего определять содер­ жание фторхинолонов в пробе по средним значениям О П . измеренным в лунках сградуировочными рас­ творами и рабочими растворами экстрактов испытуемых проб. 11 Контроль точности результатов измерения Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходи­ мости) и воспроизводимости, проводят с учетом требований Г О С Т И С О 5725-6 (раздел 5). Относительное расхождение между результатами, полученными в разных лабораториях, не долж ­ но превышать относительного стандартного отклонения воспроизводимости (см. таблицу 1). 8
Г О С Т 33634— 2015 Приложение А (рекомендуемое) Комплектация тест-си стем ы 1) «Ф то р х и н о ло н ы И Ф А » В комплектацию тест-системы входят: Планшет 96-луночный полистироловый стрипованный для иммунологических исследований, сенсибилизи­ рованный антигеном; Пакет полиэтиленовый фольгированный с зип-локом. Пленка полиэтиленовая самоклеющаяся д ля заклеивания планшетов. Растворы: № 1 — А Т — антитела к энрофлоксацину; № 2 — раствор фосфатного буфера д ля промывки с добавлением теина-20 (20-кратный концентрат). pH (7.0— 7.4). № 3 — буфер для экстракции; № 4 — К ,. № 5 — К2.№ 6 — К3. Ns 7 — К4. № 8 — К5 — градуировочные растворы с известным содержанием (мкг/дм3) энрофлоксацина; № 9 — ФК — конъюгат антител против IgG (Н + L) кролика с пероксидазой хрена (10-кратный концентрат); № 10— реакционный буферный раствор с добавлением твина-20 и бычьего сывороточного альбумина. pH 7.0— 7.4. стерильный; № 11 — раствор субстрата на основе 3.3\ 5.5-тетраметилбензидина с добавлением перекиси водорода; № 12 — стоп-реагент, раствор серной кислоты молярной концентрацией 0.5 моль/дм3; № 13 — натрия ацетат, раствор молярной концентрацией 1.5 моль/дм3. ' 1 Данный комплект реагентов является рекомендуемым и приведен д ля удобства пользователей настояще­ го стандарта. 9
Г О С Т 33634— 2015 Приложение Б (рекомендуемое) Схема заполнения л ун о к планш ета Внесение реагентов следует проводить согласно следующей схеме: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 А Ко Ко № 3 № 3 N9 11 № 11 № 19 № 19 № 27 N9 27 N9 35 N9 35 В К, К,Ы) 4 N9 4 N9 12 № 12 № 20 № 20 № 28 N9 28 N9 36 № 36 С К* К, № 5 N9 5 N9 13 № 13 № 21 № 21 N9 29 N9 29 N9 37 N9 37 0 Ко К3 № 6 N9 6 N9 14 № 14 N9 22 № 22 N9 30 N9 30 N9 38 № 38 Е к* к« № 7 N9 7 N9 15 Мг 15 № 23 № 23 N9 31 N9 31 N9 39 № 39 F Кь Кь № 8 N9 8 N9 16 № 16 N? 24 24 N9 32 N9 32 N9 40 № 40 G NB 1 № 1 № 9 N9 9 № 17 № 17 № 25 № 25 N9 33 N9 33 N9 41 К» 41 Н N9 2 N? 2 N9 10 N9 10 N9 18 № 18 № 26 N9 26 N9 34 N9 34 № 42 № 42 10
Г О С Т 33634— 2015 Приложение В (рекомендуемое) Т а б л и ц а д л я записи р е з уль та то в измерения Т а б л и ц а В.1 Значение ОП Содержание фторхинолоиа Маркировка варианта ^ 2 . 100. % о исследуемой on* lg С в экстракте с. по лункам среднее пробе С. ыкг/ды3 мкг/дм3 (мкг/кП Ко К. к . К 3 К< К о 1 № ... № 42 11
Г О С Т 33634— 2015 УДК 637.5:615.28:006.354 МКС 67.050 67.100 67.120 Ключевые слова: пищевые продукты, продовольственное сырье, иммуноферментный метод, остаточ­ ное содержание, фторхинолоны. антибиотики фторхинолонового ряда, энрофлоксацин. ципрофлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин, прецизионность метода, тест-система, антиген, антитела, оптическая плотность, ферментный конъюгат Редактор К.В Дудка Технический редактор в.Ю. Фотиева Корректор И.А Королева Компьютерная верстка А.Н. Золотаревой Сдано в набор 18.02.2015. Подписана а печать 17.03.2016. Формат 60>84^ Гарнитура Ариап. Уел. печ. л. 1.86. Уч.-иад. п. 1.40. Тираж 35 эк». Зак. 773. Издано и отпечатано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ». 123905 Москва. Гранатный пер.. 4.www.ГОСТ 33634-2015

Похожие документы